1．凡進入手術室的工作人員必須更換手術室的衣、帽、口罩、褲、鞋子必須蓋住頭發，方準入內。
2．除參加手術的有關人員外，其他人員不得入內。參觀手術需經醫教科、護理部批準，其人數不能超過手術間規定之數字。
環境要求
1．手術間應保持清潔，每次術后一切用物均應用消毒液濕式擦抹，地面、墻角需清潔干交，并以消毒液拖凈。
2．每日各手術間徹底打掃一次。
3．吸引瓶、污物桶每次用后，洗刷干凈，并以消毒液浸泡后方可使用。
4．洗滌間須保持清潔和下水道通暢，洗手護士勿將刀、針、線圈丟入水池，以防堵塞。
5．洗手間每晚與次晨須各拖地一次，洗手完畢再清潔打掃，及時沖洗水池積垢每周擦拭以保持水池潔白通暢。
6．更衣室清潔工作，地面，便池要求潔白無臭味，每日拖地二次，每周總打掃一次。
7．保持洗澡間整潔，防止毛發等物堵塞下水道，非本室人員及非當日手術人員，不得在該洗澡間洗澡。
8．辦公室每日須擦拭桌面并清掃拖地，使用后隨時保持清潔整齊，每月大掃除一次。
9．手術室在嚴格劃分無菌，有菌區域后，手術按無菌與感染分室，因診斷不明或其它原因在無菌手術間施行有菌手術后，應進行嚴格嚴密的清潔和消毒。
消毒隔離制度
1．無菌手術和污染手術應分室進行，如必須在同一手術間進行，應先做無菌手術，后做污染手術。
2．手術前后以0.1%有效氧消毒液或0.5 %過氧乙酸擦拭手術床、桌、臺、凳、用具、門窗等，并用思康消毒液拖擦地面，室內經常保持醫療器械、物品清潔整齊，每周大搞一次衛生。術前30-60分鐘之前啟動導流，做污染手術后按常規要求及時消毒處理。
3．無菌罐、無菌鑷（鉗）、無菌盒采用滅菌后干保存一用一滅菌。各種治療包、手術包、敷料包經高壓蒸汽滅菌后，有效期為兩周。
4．用過的手術器械、手套清洗后分別置于超聲波清洗機清洗，然后將器械放入烤箱烤干，涂油備用，手套晾干備用。用過的布類、敷料送洗衣房清洗煮沸消毒30分鐘。乙型肝表面抗原陽性患者和綠膿桿菌感染患者用過的器械，置于500mg/L含氯消毒液中浸泡30分鐘，取出清洗烤干，一次性敷料用后送大地維康公司焚燒。對用過的手術間，以0.5%過氧乙酸擦試手術床、麻醉桌、凳、器械臺、門、窗、用具、地面以思康消毒液拖擦消毒。
5．破傷風、氣性壞疽等特異性感染手術患者用過的器械、浸泡、沖洗后經高壓蒸汽滅菌再洗凈、烘干、涂油備用。用過的布類送高壓滅菌后再送洗衣房清洗煮沸消毒30分鐘。用過的敷料送大地維康公司焚燒。不能耐高溫的精密儀器，用低溫滅菌密閉。
6．手術包用化學指示劑檢測滅菌效果，包內放置二張指示卡，每月做一次生物指示劑檢測（即用嗜熱脂肪桿菌芽胞檢測）。
7．手術間每月做空氣細菌培養一次，按規定和手術室等級放置平皿。
8．手術室應設置消毒物品貯藏間，各種無菌包經高壓滅菌有效期為7天，霉季為3天。
9．無菌包內必須放有化學指示卡和3M膠帶。
10．已打開的無菌包，必須用無菌單嚴密遮蓋，不得超過4小時。
11．高壓滅菌物品、手術間空氣、手術者手、醫用器材（熏蒸、浸泡），消毒液、凈化水、操作臺，每月細菌檢測培養一次。
12．各手術間周期清潔消毒規定。
13．手術者戴好手套后，不得任意行走及離開手術室。
14．任何人發現或被指出違反無菌操作時，必須立即糾正，術者臍平面以下區域均視為有菌區，如器械等無菌物品掉至平面以下，必須重新滅菌后才能使用。
15．器械護士不可從術者身后傳遞器械，需要時可在術者臂下傳遞，但不能低于臺面。
16．已取出的無菌物品，雖然未污染，但也不能放回原容器中，必須重新滅菌后再用。
17．手套破損，立即更換，凡疑有物品污染，必須重新滅菌后再用。
18．術中被污染的器械，如切開消化道的剪、刀，均須另放于彎盆內，不能重新使用。